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溶菌酶的分離純化
發布日期：2018-01-03 瀏覽次數：3340
1. 蛋清樣品的準備
市售新鮮雞蛋5個，破蛋殼取出蛋清，加入1.5倍體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，攪拌均勻，并調pH 7.0，然后用八層紗布過濾，留取上清液，量取體積并記錄，留0.4mL上清液，并加入0.4mL甘油－20℃凍存備用。
2.陽離子交換層析
（1）陽離子交換樹脂的再生：20g Amberlite-CG-50陽離子交換樹脂用0.5mol/L NaOH浸泡30min，水洗至中性，再用0.5mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性。
（2）平衡：在燒杯中將再生好的陽離子交換樹脂中用0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0平衡。
（3）吸附：在已平衡好的陽離子交換樹脂中加入蛋清樣品，攪拌吸附1h（不能用磁力攪拌器）。
（4）洗滌：倒去其余上清液，樹脂用100mL0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0洗滌3遍。
（5）裝柱：將樹脂攪拌均勻裝入2.6cm×30cm層析柱，再用300mL含0.05 mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0洗滌雜蛋白。（裝柱前，先檢測層析柱是否潔凈，保證所有接頭密閉、管道暢通；裝柱時，流速不得超過3mL/min，全過程不能出現“流干”現象）
（6）洗脫：用300mL含0.5 mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0以3mL/min流速進行洗脫，合并光吸收高峰管，量取體積并記錄，留0.4mL上清液并加入0.4mL甘油－20℃凍存備用。
3. 硫酸銨沉淀
每100mL上清液中緩慢加入35g固體硫酸銨，溶解后凈置30min，10 000r/min離心10min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0溶解，留0.05mL上清液，并加入0.05mL甘油，－20℃凍存備用。
4. 分子篩層析
將溶解后的硫酸銨沉淀樣品10 000r/min離心3min、上光已用pH 7.0 0.1mol/L NaCl的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液平衡好的Sephacyl S-100HR柱，洗脫，洗脫流速為15mL／h，分部收集洗脫峰，2mL／管。合并光吸收高峰管。
5. 透析濃縮
用含50％甘油的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0透析濃縮4h，－20℃分裝凍存備用。
魏經理
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